利用消化爐和定氮儀對(duì)稻米中蛋白質(zhì)進(jìn)行研究
蛋白質(zhì)是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，細(xì)胞和生物體在完成由基因編碼的生命活動(dòng)過程中需要許多不同的蛋白質(zhì)協(xié)同作用，蛋白質(zhì)是細(xì)胞做功的工具，與生命的起源和進(jìn)化都密切相關(guān)。所以食品中蛋白質(zhì)的多少，不僅表示食品的質(zhì)量，也關(guān)系著人體健康。食品中蛋白質(zhì)含量高低是評(píng)價(jià)食物營(yíng)養(yǎng)成份的主要指標(biāo)之一。稻米是人類重要的糧食作物，稻米蛋白質(zhì)因其為合理的蛋白及氨基酸組成而表現(xiàn)出優(yōu)良的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，蛋白質(zhì)含量不僅影響其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，而且也對(duì)蒸煮品質(zhì)有重要影響。在評(píng)價(jià)稻米品質(zhì)的相標(biāo)準(zhǔn)中蛋白質(zhì)及其含量被認(rèn)為是評(píng)價(jià)品質(zhì)并為深加工行業(yè)生產(chǎn)提供工藝參數(shù)的重要指標(biāo)之一。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，常見的有定氮儀法、紫外吸收法、雙縮脲法、消化爐法和質(zhì)譜法等。
有報(bào)道紫外吸收法無(wú)法測(cè)出牛奶、酸奶的蛋白含量，測(cè)出的豆?jié){蛋白含量也與實(shí)際值相差較大，不具實(shí)際使用價(jià)值。雙縮脲法是傳統(tǒng)的分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的方法，準(zhǔn)確度好，精密度好，呈色穩(wěn)定性好，試劑單一，方法簡(jiǎn)便，但靈敏度不高，約為1mg，故現(xiàn)在已很少使用。考馬斯亮藍(lán)染色法快速、靈敏，但只有作微量蛋白測(cè)定時(shí)的結(jié)果才準(zhǔn)確，因此在實(shí)驗(yàn)前將樣品稀釋至蛋白濃度為0. 1-1mg/mL，而且實(shí)驗(yàn)必須在1h內(nèi)完成，不然測(cè)試結(jié)果不準(zhǔn)確。
質(zhì)譜分析法中肽和蛋白的質(zhì)譜序列測(cè)定方法具有快速、用量少、易操作等優(yōu)點(diǎn)，但是質(zhì)譜的準(zhǔn)確性對(duì)測(cè)定結(jié)果有很大影響，因此質(zhì)譜測(cè)序現(xiàn)在仍很難被應(yīng)用于未知蛋白的序列測(cè)定。測(cè)定蛋白質(zhì)最常用的方法是凱氏定氮法，它是測(cè)定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡(jiǎn)單的方法之一，被國(guó)際國(guó)內(nèi)作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。
凱氏定氮儀法適用樣品范圍廣泛、測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，但是傳統(tǒng)的凱氏定氮法多利用開氏瓶消化和半微量定氮蒸餾器定氮，裝置復(fù)雜，蒸餾過程較難控制，易發(fā)生倒吸現(xiàn)象而致實(shí)驗(yàn)失敗，并且消化時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境污染較大，不利于實(shí)際使用。
本實(shí)驗(yàn)中使用定氮消化爐和自動(dòng)定氮儀代替前兩者，既兼顧凱氏定氮法的準(zhǔn)確性，操作又非常方便，節(jié)省時(shí)間，提高了工作效率，可適合大批量樣品測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定本地7種稻米中的蛋白質(zhì)含量，并對(duì)測(cè)試結(jié)果作比較分析，為人們食用稻米提供參考。
1實(shí)驗(yàn)部分：
1.1實(shí)驗(yàn)材料
巢湖市半湯鎮(zhèn)糧店購(gòu)買的絲苗米、汕優(yōu)米、東北大米、當(dāng)?shù)鼐久住⑴疵滓约皬膹]江縣白山鎮(zhèn)帶回的當(dāng)?shù)氐脑绲久缀屯淼久坠?種樣品。
1.2主要儀器和試劑：
自動(dòng)定氮儀（浙江托普儀器有限公司），梯度液晶消化爐（浙江托普分析儀器有限公司），電子分析天平，25 mL酸式滴定管。混合催化劑：硫酸鉀（K2SO4）100g，硫酸銅（CuSO4?5H2O）10g及硒（Se）1g，分別研磨成粉，再混合均勻。濃硫酸[H2SO4，ρ=1.84g/cm3，化學(xué)純]。硫酸標(biāo)準(zhǔn)液[c（1/2H2SO4）=0.02 mol/L]：先配制[c （1/2H2SO4）=0.1 mol/L]硫酸溶液，標(biāo)定后稀釋5倍。氫氧化鈉溶液[c（NaOH）=10mol/L]：400g氫氧化鈉放入1L的燒杯中，加入600mL的無(wú)CO2蒸餾水溶解，冷卻后，用無(wú)CO2的蒸餾水配成1L，充分混勻，儲(chǔ)于塑料瓶中。混合指示劑：溶解0.099g的溴甲酚綠和0.066g甲基紅于100mL的乙醇[w(CH3CH2OH)=95%]中。硼酸指示劑溶液[ρ（H3BO3）=20g/L]：溶解0硼酸于950mL的熱蒸餾水中，冷卻后，加入20mL的混合指示劑，充分混勻后，小心滴加氫氧化鈉溶液[c（NaOH）=0.1mol/L]，直至溶液呈紅紫色（pH約4.5），稀釋成1L。
1.3實(shí)驗(yàn)方法：
稱取烘干、磨碎（0.25mm）米粉0.2000g-0.4000g，置于50mL消煮管中，加混合催化劑1.8g，滴加幾滴蒸餾水濕潤(rùn)樣品，再加入濃硫酸5mL，小心搖勻后蓋上小漏斗，置消化爐上消煮至溶液清亮帶藍(lán)綠色時(shí)，再加熱30分鐘后關(guān)上消化爐冷卻。將自動(dòng)定氮儀上的蒸餾水、氫氧化鈉溶液、硼酸指示劑溶液、稀釋液、冷卻水、集液瓶連接好，打開儀器開關(guān)，將盛有消化液的消化管直接上機(jī)定氮。結(jié)束后用硫酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定所得樣品。每批樣品測(cè)定同時(shí)按同樣操作步驟進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，以校正試劑誤差。同時(shí)使用傳統(tǒng)的凱氏定氮法測(cè)定樣品，兩者結(jié)果進(jìn)行比較。
1.4統(tǒng)計(jì)方法：
每個(gè)樣品分別做3個(gè)平行樣，取其均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2結(jié)果與討論：
2.1樣品的用量
稱樣量的大小取決于樣品的含氮量，若含氮1%-5%，稱樣量為0.2000g-0.4000g，可根據(jù)含氮量的水平適當(dāng)增減稱樣量。
2.2樣品消化中注意事項(xiàng)：
樣品加入消化管時(shí)注意避免樣品黏附在管壁上防止消化不充分；緩慢調(diào)節(jié)消化爐上升溫度，避免溫度上升過快使消化管中消化液沖出，造成污染和結(jié)果不準(zhǔn)確；樣品消化澄清后，應(yīng)繼續(xù)消化30分鐘，使樣品消化更完全，結(jié)果更為準(zhǔn)確。
2.3消化定氮裝置
采用智能數(shù)控消化爐代替?zhèn)鹘y(tǒng)開氏瓶，操作方面，可同時(shí)消化多個(gè)樣品，適合批量測(cè)樣。自動(dòng)定氮儀不用人工加酸、加堿等繁瑣操作，使用方便，但要注意蒸餾、加酸、加堿、稀釋的時(shí)間控制和加熱功率選擇，盡量定氮完全。定氮儀在蒸餾過程中停冷卻水，缺液、安全門未關(guān)、樣品位置未放好、集收液溫度超溫等意外情況儀器提示或報(bào)警，安全高效。
2.4測(cè)定條件選擇
自動(dòng)定氮儀采用單片微機(jī)控制，大屏幕液晶屏顯示，接通電源后按提示操作，簡(jiǎn)單方便，控制可靠。樣品參數(shù)設(shè)置中，蒸餾時(shí)間為00.0-99.0分鐘，加酸時(shí)間為00.0-30.0秒，稀釋時(shí)間00.0-30.0秒，加堿時(shí)間00.0-30.0秒，蒸餾有四種模式，即功率為50%，60%，80%和100%。以上參數(shù)可根據(jù)實(shí)際情況靈活選擇，可自由調(diào)整。本次實(shí)驗(yàn)中參數(shù)選擇為：蒸餾時(shí)間為07.0分鐘，加酸時(shí)間為05.0秒，稀釋時(shí)間05.0秒，加堿時(shí)間05.0秒，蒸餾功率為80%。
2.5粗蛋白質(zhì)凱氏定氮法測(cè)定的氮中還包含有氨基酸、酰氨等非蛋白質(zhì)氮，由此計(jì)算出的蛋白質(zhì)稱為“粗蛋白質(zhì)”，如果蛋白質(zhì)用重金屬鹽等沉淀分離后進(jìn)行全氮測(cè)定，由氮換算的蛋白質(zhì)含量稱為“純蛋白質(zhì)”。
2.6測(cè)試結(jié)果分析表1可見同一樣品的三次測(cè)定結(jié)果差異很小，表明自動(dòng)定氮儀法測(cè)定結(jié)果很準(zhǔn)確，重現(xiàn)性非常好。自動(dòng)定氮儀法與傳統(tǒng)凱氏法對(duì)同一樣品測(cè)定結(jié)果基本一致（表2）。
不同稻米蛋白質(zhì)含量差異較大（表2），絲苗米、汕優(yōu)米和當(dāng)?shù)鼐镜久椎鞍踪|(zhì)含量最大，三者之間沒有顯著差異；晚稻稻米蛋白質(zhì)含量較前三者低，比東北大米稍高；早稻米和糯米蛋白質(zhì)含量最低，且兩者沒有顯著性差異。
