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5種入侵植物葉綠素的提取與含量測(cè)定
　紫莖澤蘭( Eupatorium adenophorum Sp reng)系菊科澤蘭屬多年生草本植物,一般高0. 8～1. 2 m,最高可達(dá)2. 5 m,莖暗紫褐色,被灰色銹毛,葉對(duì)生,葉片棱形;頭狀花序,瘦果五棱形,具冠毛;具有極強(qiáng)的生命力,全株有毒,不僅與農(nóng)田、森林爭(zhēng)養(yǎng)料和水分,其纖毛、花粉等還會(huì)對(duì)人、畜造成危害。
飛機(jī)草( Eupatorium odoratum L. )為菊科植物,別名香澤蘭。植株高達(dá)3～7 m,根莖粗壯,莖直立,分枝伸展;葉對(duì)生,呈卵狀三角形,瘦果能借冠毛隨風(fēng)傳播,其果實(shí)成熟季節(jié)多為干燥多風(fēng)的旱季,擴(kuò)散力強(qiáng),蔓延迅速,種子休眠期短。植株有較強(qiáng)的異株克生作用,危害多種作物,并抑制鄰近植物生長(zhǎng),還能使昆蟲拒食。其葉內(nèi)含香豆類素( coumarins)等有毒活性化合物,能引起皮膚紅腫、起泡,誤食嫩葉會(huì)引起頭暈、嘔吐,還可引起家畜、家禽和魚類中毒。
空心蓮子草(A lternanthera philoxeroides Bunbury)是莧科多年生宿根草本植物,別名水花生、喜旱蓮子草、空心莧。莖基部匍匐,上部伸展,中空,有分枝,葉對(duì)生,長(zhǎng)圓狀倒卵形或倒卵狀披針形,頭狀花序。根系繁殖能力強(qiáng),與本地植物爭(zhēng)奪水分、養(yǎng)分。
水葫蘆( Eichhornia crassipes ) ,又叫鳳眼蓮,根生于節(jié)上,根系發(fā)達(dá),靠毛根吸收養(yǎng)分水分,主根(肉根)分蘗下一代。葉單生,直立,葉片卵形或腎圓形,稈(莖)灰色,泡囊稍帶點(diǎn)紅色,嫩根為白色,老根偏黑色。多年浮水草本。
鳳眼蓮對(duì)其生活的水面采取野蠻的封鎖,擋住陽(yáng)光,導(dǎo)致水下植物得不到足夠光照而死亡,破壞水下動(dòng)物的食物鏈,導(dǎo)致水生動(dòng)物死亡。同時(shí),鳳眼蓮還有富集重金屬的能力,死后腐爛體沉入水底形成重金屬高含量層,直接殺傷底棲生物。馬纓丹(Lantana cam ara L inn. )系馬鞭草科多年生植物,又叫五色梅、臭草。多年生蔓性灌木,高1～2 m,葉對(duì)生,卵形或心臟形,有臭味。莖枝方柱形,通常有短而下彎的細(xì)刺和柔毛。枝葉及未熟果有毒,人畜誤食會(huì)造成慢性肝中毒,有發(fā)燒、衰弱、嘔吐、腹瀉、步履不穩(wěn)、呼吸急促、昏迷、黃疸等癥狀。
以上5種植物都是云南常見(jiàn)的入侵植物,對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成危害,對(duì)人畜健康造成影響,對(duì)自然環(huán)境產(chǎn)生破壞作用;但這些植物都是綠色植物,具有葉綠素,如果能把這些植物中的葉綠素加以充分利用,即能變廢為寶。葉綠素不僅在光合作用中起到吸收光能、傳遞光能的作用,而且還具有造血功能,可解除體內(nèi)殺蟲劑與藥物殘留,并具有養(yǎng)顏美膚以及多種保健功能(如提供維生素、維持酶活性、解毒、消炎、脫臭) 。就以上5種入侵植物的葉綠素提取工藝進(jìn)行研究并測(cè)定葉綠素含量,可為有效控制這些有害植物的生態(tài)危害及進(jìn)一步合理利用奠定基礎(chǔ)。
1　材料與方法
1. 1　材料
紫莖澤蘭、飛機(jī)草、空心蓮子草、馬纓丹采集于楚雄師范學(xué)院校園內(nèi),水葫蘆采集于校園南大門外池塘。5種試材均由楚雄師范學(xué)院李國(guó)樹(shù)鑒定。另外還需要幾款測(cè)定葉綠素含量的儀器，如葉綠素含量測(cè)定儀、SPAD502葉綠素儀。1. 2　方法
1. 2. 1　葉綠素的提取　本試驗(yàn)采用超聲波處理和未超聲處理2種方法,分別提取5種植物的葉綠素。超聲波處理:每個(gè)樣品取新鮮試材3 g,剪碎,加入5 ml 80%丙酮、少許碳酸鈣和石英砂研磨勻漿,轉(zhuǎn)入25 ml燒杯,用KQ5200B 型超聲波清洗器30 ℃超聲處理5 min,過(guò)濾,濾液轉(zhuǎn)入10 ml量筒中,加入少量80%丙酮將研缽洗凈,過(guò)濾后濾液一并轉(zhuǎn)入量筒中,定容至10 ml,混勻,取5 ml轉(zhuǎn)入25 ml量筒中,加入80%丙酮,并定容至25 ml。未超聲處理:操作過(guò)程同上,僅省略超聲波處理程序。
1. 2. 2　葉綠素的光吸收測(cè)定及其比較　利用UV - 2401PC型紫外分光光度計(jì),測(cè)定超聲波處理和未超聲處理提取液在663 nm和645 nm的吸光度,以80%丙酮為對(duì)照;計(jì)算樣品葉綠素含量。同時(shí),利用TZZS可見(jiàn)光光度計(jì)測(cè)定樣品663 nm和645 nm處吸光度,并分別計(jì)算樣品葉綠素含量。
2　結(jié)果與分析
2. 1　葉綠素吸收峰的分析比較
2. 1. 1　水葫蘆中葉綠素的吸光度　經(jīng)過(guò)超聲處理和未超聲處理的水葫蘆提取液中葉綠素的吸收峰和吸光度見(jiàn)圖1和表1。表1結(jié)果表明,水葫蘆超聲處理和未超聲處理的提取液中葉綠素最高吸收峰在波長(zhǎng)330. 00、330. 50 nm處,最高Abs分別為2. 530 0和3. 474 8。說(shuō)明水葫蘆在不超聲處理的提取液中葉綠素吸光度高,在提取水葫蘆葉綠素時(shí)不用超聲波處理,直接提取效果更好。
2. 1. 2　紫莖澤蘭中葉綠素的吸光度　經(jīng)過(guò)超聲處理和未超聲處理的的紫莖澤蘭提取液中葉綠素的吸收峰和吸光度見(jiàn)圖2和表2。由表2可知,紫莖澤蘭超聲處理和未超聲處理的提取液中葉綠素吸光度最高峰在波長(zhǎng)319 nm和325 nm處,Abs均為5. 000 0,說(shuō)明紫莖澤蘭超聲處理和未超聲處理提取液中葉綠素吸光度一樣。
2. 1. 3　馬纓丹中葉綠素的吸光度　經(jīng)過(guò)超聲處理和未超聲處理的馬纓丹提取液中葉綠素的吸收峰和吸光度見(jiàn)圖3和表3。由表3表明,馬纓丹超聲處理和未超聲處理的提取液中葉綠素分別在波長(zhǎng)321. 50 nm和326. 00 nm處有最高吸收峰,Abs均為5. 000 0,說(shuō)明馬纓丹超聲處理和未超聲處理的提取液中葉綠素吸光度相同。
2. 1. 4　空心蓮子草中葉綠素的吸光度　經(jīng)過(guò)超聲處理和未超聲處理的空心蓮子草提取液中葉綠素的吸收峰和吸光度見(jiàn)圖4和表4。由表4表明,空心蓮子草超聲處理和未超聲處理的提取液中葉綠素吸光度在波長(zhǎng)432. 50 nm和343. 50 nm處有最高吸收峰,Abs分別為3. 640 7和5. 000 0,說(shuō)明空心蓮子草的葉綠素不超聲處理提取效果更好。
2. 1. 5　飛機(jī)草中葉綠素的吸光度　經(jīng)過(guò)超聲處理和未超聲處理的飛機(jī)草提取液中葉綠素的吸收峰和吸光度見(jiàn)圖5和表5。由表5表明,經(jīng)過(guò)超聲處理和未超聲處理的飛機(jī)草提取液中葉綠素在波長(zhǎng)331. 00 nm和330. 50 nm處有最高吸收峰,Abs分別為5. 000 0和3. 031 4,說(shuō)明飛機(jī)草中葉綠素經(jīng)過(guò)超聲處理提取,效果更好。
2. 1. 6　5種植物超聲處理后的吸收峰比較　由圖6可知,水葫蘆、紫莖澤蘭、馬纓丹、空心蓮子草、飛機(jī)草等5種植物超聲處理后,紫莖澤蘭、馬纓丹和飛機(jī)草的最高吸收峰基本相同,而水葫蘆和空心蓮子草的最高吸收峰有明顯差異,即不同的植物材料經(jīng)過(guò)超聲處理后效果不同。
2. 1. 7　5種植物未超聲處理的吸收峰比較　由圖7可知,水葫蘆、紫莖澤蘭、馬纓丹、空心蓮子草、飛機(jī)草等5種植物不經(jīng)過(guò)超聲處理,紫莖澤蘭、馬纓丹、空心蓮子草等3種植物的最高吸收峰基本相同,水葫蘆和飛機(jī)草的最高吸收峰有明顯差異,即5種植物不超聲處理直接提取效果一樣。
2. 2　葉綠素濃度的比較
2. 2. 1　5種植物超聲處理葉綠素濃度測(cè)定　用UV - 2401PC型紫外分光光度計(jì)測(cè)定5種植物超聲處理后提取液在波長(zhǎng)為663 nm和645 nm 的葉綠素濃度(表6) 。表6結(jié)果表明,在波長(zhǎng)663 nm 下,空心蓮子草的葉綠素濃度最高( 0. 016 7mg/L) 。在波長(zhǎng)645 nm 下, 馬纓丹的葉綠素濃度最高(0. 029 8 mg/L) 。說(shuō)明在經(jīng)過(guò)超聲波處理的條件下,水葫蘆、馬纓丹、空心蓮子草等在波長(zhǎng)663 nm下測(cè)濃度為宜,紫莖澤蘭、飛機(jī)草在波長(zhǎng)645 nm下測(cè)定濃度為宜。
2. 2. 2　5 種植物未超聲處理葉綠素濃度測(cè)定　用UV -2401PC型紫外分光光度計(jì)測(cè)5種植物未超聲處理提取液在波長(zhǎng)為663 nm和645 nm下的葉綠素濃度(表7) 。表7 表明,在波長(zhǎng)663 nm 下, 空心蓮子草的葉綠素濃度最高(0. 046 5 mg/L) ;在波長(zhǎng)645 nm下,紫莖澤蘭的葉綠素濃度最高(0. 032 6 mg/L) 。說(shuō)明在直接提取的條件下,在波長(zhǎng)為663 nm下測(cè)定空心蓮子草、飛機(jī)草的葉綠素為宜,波長(zhǎng)為645nm下測(cè)定水葫蘆、紫莖澤蘭、馬纓丹的葉綠素為宜。2. 3　用722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)葉綠素吸光度及含量在波長(zhǎng)663 nm和645 nm下,用722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量5種植物提取液葉綠素的吸光度(表8) 。
根據(jù)文獻(xiàn)[ 2 - 3 ]的方法,將測(cè)得的數(shù)值代入公式: ( 1) Ca(mg/L) = 12. 7A663 - 2. 69A645 ; ( 2 ) Cb (mg/L ) = 22. 9A645 -4. 68A663 ; (3) Ct =Ca + Cb = 8. 02A663 + 20. 21A645 ,計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的濃度。最后再根據(jù)葉綠素提取液濃度計(jì)算出單位鮮重葉片中葉綠素的含量(表9、表10) 。
經(jīng)SPSS軟件對(duì)兩種方法提取的葉綠素含量進(jìn)行處理,得5種植物葉綠素含量的估計(jì)邊緣均值,結(jié)果空心蓮子草葉綠素含量最高,為0. 430 250 mg/g FW;紫莖澤蘭的葉綠素含量第二,為0. 370 750 mg/g FW; 馬纓丹葉綠素含量第三, 為0. 337 750 mg/g FW; 飛機(jī)草第四, 葉綠素含量為0. 310 060mg/g FW;水葫蘆葉綠素含量最低,為0. 111 750 mg/g FW。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,無(wú)論是超聲處理還是未超聲處理, 5種植物間總?cè)~綠素含量差異均達(dá)極顯著水平,兩種方法測(cè)定的葉綠素含量差異也達(dá)極顯著水平。經(jīng)過(guò)超聲處理后,空心蓮子草葉綠素含量最高,其次是飛機(jī)草,再次是馬纓丹,然后是紫莖澤蘭,最低的是水葫蘆。未經(jīng)超聲波處理直接提取葉綠素時(shí),紫莖澤蘭葉綠素含量最高,其次是空心蓮子草,再次是馬纓丹,然后是飛機(jī)草,最低的是水葫蘆。兩種方法比較,馬纓丹、空心蓮子草和飛機(jī)草超聲處理后提取的葉綠素含量比未超聲處理提取的高;紫莖澤蘭的比未超聲處理提取的低,而水葫蘆沒(méi)明顯差異。
3　討論
3. 1　環(huán)境因素對(duì)葉綠素的影響
杜敏華對(duì)女貞、大葉黃楊、月季、金葉女貞、三葉草等5種常見(jiàn)城市綠化植物進(jìn)行了大氣污染對(duì)其葉綠素含量影響的研究,認(rèn)為污染嚴(yán)重的城市區(qū)域葉綠素總含量相對(duì)較低。那么,其他環(huán)境因素,如干旱、低溫、元素缺乏等是否會(huì)影響水葫蘆、紫莖澤蘭、馬纓丹、空心蓮子草、飛機(jī)草等5種植物葉綠素的含量? 這有待進(jìn)一步探討。
3. 2　5種植物的應(yīng)用前景
游秀花等以杉木針葉提取葉綠素,經(jīng)皂化、鋅代及成鹽反應(yīng)制備葉綠素鋅鈉鹽。馬自超用竹葉制取葉綠素銅鈉鹽。能否將水葫蘆、紫莖澤蘭、馬纓丹、空心蓮子草、飛機(jī)草等5種植物中所含的葉綠素轉(zhuǎn)換為葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉呢? 這5種植物的色素中是否含有毒性? 如果有,如何脫毒效果最好? 這些問(wèn)題還有待于進(jìn)一步研究。
4　結(jié)論
通過(guò)不同的處理方法進(jìn)行葉綠素提取,發(fā)現(xiàn)用不同的處理方法,紫莖澤蘭在波長(zhǎng)為310. 00 nm和325. 00 nm條件下,葉綠素吸光度相同且最高(Abs為5. 000 0) 。紫莖澤蘭、空心蓮子草、飛機(jī)草、水葫蘆、馬纓丹5種植物材料中,葉綠素含量差異極顯著。5種材料的葉綠素含量從高到底依次為空心蓮子草(0. 430 250 mg/g FW) 、紫莖澤蘭(0. 370 075 mg/g FW) 、馬纓丹(0. 337 750 mg/g FW) 、飛機(jī)草( 0. 310 660mg/g FW) 、水葫蘆( 0. 111 750 mg/g FW) 。超聲處理后提取葉綠素和不處理直接提取葉綠素,差異極顯著。紫莖澤蘭以不處理直接提取為宜,馬纓丹、空心蓮子草和飛機(jī)草超聲處理后再提取為宜,水葫蘆不受超聲處理影響。這5種常見(jiàn)入侵植物葉綠素的提取和應(yīng)用前景中,空心蓮子草是葉綠素提取的最佳材料,其次是紫莖澤蘭和馬纓丹。