用凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)的含量
用凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)的含量
測定食品中蛋白質(zhì)的含量有很多種方法，最常見也最普遍的就是凱氏定氮法。本文我們就主要通過介紹凱氏定氮法的整個操作流程，來學(xué)習(xí)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理，以及掌握凱氏定氮法的操作技術(shù)。包括樣品消化、蒸餾、滴定和蛋白質(zhì)含量的計算。
凱氏定氮法實驗原理：蛋白質(zhì)是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，留在消化液中，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量來乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量。因為食品中除蛋白質(zhì)外，還含有其它含氮物質(zhì)，所以此蛋白質(zhì)稱為粗蛋白。粗蛋白也可直接用儀器測出，如粗蛋白測定儀，它有三種型號，分別為KDN-04A粗蛋白測定儀，KDN-04B粗蛋白測定儀，KDN-04C粗蛋白測定儀。KDN系列凱氏定氮儀主要測定種子、糧食、食品、乳制品、飲料、飼料、土壤及其他農(nóng)副產(chǎn)品中氮的含量。
凱氏定氮法儀器與試劑：
（一）試劑
硫酸銅（CuSO4?5H20）、硫酸鉀、硫酸（密度為1.8419g/L）、硼酸溶液（20g/L）、氫氧化鈉溶液（400g/L）、0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、混合指示試劑：0.1%甲基紅乙溶液液1份，與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液5份臨用時混合、黃豆粉。
（二）儀器
微量定氮蒸餾裝置
凱氏定氮法實驗步驟
1、樣品消化
稱取黃豆粉約0.3g（±0.001g），移入干燥的100mL凱氏燒瓶中，加入0.2g硫酸銅和6g硫酸鉀，稍搖勻后瓶口放一小漏斗，加入20mL濃硫酸，將瓶以450角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上，使用萬用電爐，在通風(fēng)櫥中加熱消化，開始時用低溫加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止后，再升高溫度保持微沸，消化至液體呈藍綠色澄清透明后，繼續(xù)加熱0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，無損地轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻備用，即為消化液。
試劑空白實驗：取與樣品消化相同的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸，按以上同樣方法進行消化，冷卻，加水定容至100mL，得試劑空白消化液。
2、定氮裝置的檢查與洗滌
檢查微量定氮裝置是否裝好。在蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水約三分之二，加甲基紅指示劑數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。
測定前定氮裝置如下法洗滌2~3次：從樣品進口入加水適量（約占反應(yīng)管三分之一體積）通入蒸汽煮沸，產(chǎn)生的蒸汽沖洗冷凝管，數(shù)分鐘后關(guān)閉夾子a，使反應(yīng)管中的廢液倒吸流到反應(yīng)室外層，打開夾子b由橡皮管排出，如此數(shù)次，即可使用。
3、堿化蒸餾
量取硼酸試劑20mL于三角瓶中，加入混合指示劑2~3滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夾a關(guān)閉，螺旋夾b開啟的狀態(tài)下，準(zhǔn)確吸取10.0mL樣品消化液，由小漏斗流入反應(yīng)室，并以10mL蒸餾水洗滌進樣口流入反應(yīng)室，棒狀玻塞塞緊。使10mL氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，用少量水沖洗立即將玻塞蓋堅，并加水于小玻杯以防漏氣，開啟螺旋夾a，關(guān)閉螺旋夾b，開始蒸餾。通入蒸汽蒸騰10min后，移動接收瓶，液面離開凝管下端，再蒸餾2min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，準(zhǔn)備滴定。
同時吸取10.0mL試劑空白消化液按上法蒸餾操作。
4、樣品滴定
以0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰色為終點。
5、數(shù)據(jù)記錄
項 目 第一次 第二次 第三次
樣品消化液（mL）
滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（mL）
消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液平均值（mL）
結(jié)果計算
式中 X——樣品蛋白質(zhì)含量（g/100g）；
V1——樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；
V2——空白滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；
c——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度（mol/L）；
0.0140 ——1.0mL鹽酸 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量（g）；
m——樣品的質(zhì)量（g）；
F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般食物為6.25；乳制品為6.38；面粉為5.70；
高梁為6.24；花生為5.46；米為5.95；大豆及其制品為5.71；肉與肉制品為
6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵5.30。
計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
注意事項及說明
1、本法也適用于半固體試樣以及液體樣品檢測。半固體試樣一般取樣范圍為2.00g~5.00g；液體樣品取樣10.0mL~25.0mL（約相當(dāng)?shù)?0mg~40mg）。若檢測液體樣品，結(jié)果以g/100mL表示。
2、消化時，若樣品含糖高或含脂及較多時，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失。可加入少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑減少泡沫產(chǎn)生。
3、消化時應(yīng)注意旋轉(zhuǎn)凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對樣品徹底消化。若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入數(shù)滴過氧化氫后，再繼續(xù)加熱消化至完全。
4、硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40℃，否則氨吸收減弱，造成檢測結(jié)果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。
5、在重復(fù)性條件下獲得兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
