酶抑制率法（分光光度法）
在一定條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。正常情況下，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計(jì)在412nm處測定吸光度隨時(shí)間的變化值，計(jì)算出抑制率，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。
10.1 pH8.0緩沖溶液：分別取11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。
10.2 顯色劑：分別取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，4° C冰箱中保存。
10.3 底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩１４嫫诓怀^兩周。
10.4 乙酰膽堿酯酶：根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3 min的吸光度變化D A0值應(yīng)控制在0. 3以上。搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫４嫫诓怀^四天。
10.5 可選用由以上試劑制備的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的D A0值應(yīng)控制在0. 3以上。
11 儀器
11.1 分光光度計(jì)或相應(yīng)測定儀及常量天平。
12 分析步驟
12.1 樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取樣品1g，放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖溶液，振蕩1~2min，倒出提取液，靜置3~5min，待用。
12.2 對照溶液測試： 先于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37° C放置15min以上（每批樣品的控制時(shí)間應(yīng)一致）。加入0.lmL底物搖勻，此時(shí)檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，記錄反應(yīng)3 min的吸光度變化值DA0。
12.3 樣品溶液測試：先于試管中加入2.5mL樣品提取液，其它操作與對照溶液測試相同，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值DAt。
13 結(jié)果的表述計(jì)算
13.1 結(jié)果計(jì)算
檢測結(jié)果按公式計(jì)算：抑制率(%)=[ (DA0-DAt)/ DA0]×100
式中：DA0 棗對照溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值； DAt 棗樣品溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值；
13.2 結(jié)果判定
結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。當(dāng)蔬菜樣品提取液對酶的抑制率≥50%時(shí)，表示蔬菜中有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，樣品為陽性結(jié)果。陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗(yàn)2次以上。對陽性結(jié)果的樣品，可用其它方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。
14 附則
14.1酶抑制率法技術(shù)指標(biāo)
14.1.1 靈敏度指標(biāo)：酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限見表2酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限
農(nóng)藥名稱 檢出限mg/kg 農(nóng)藥名稱 檢出限mg/kg
敵敵畏 0.1 氧化樂果 0.8
對硫磷 1.0 甲基異柳磷 5.0
辛硫磷 0.3 滅多威 0.1
甲胺磷 2.0 丁硫克百威 0.05
馬拉硫磷 4.0 敵百蟲 0.2
樂果 3.0 呋南丹 0.05
14.1.2 符合率：在檢出的抑制率≥50%的30份以上樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗(yàn)證，陽性結(jié)果的符合率應(yīng)在80%以上。
15 說明
15.1 蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時(shí)，可采取整株（體）蔬菜浸提。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。
15.2 當(dāng)溫度條件低于37° C，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對延長，延長時(shí)間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對照測試3min的吸光度變化D A0值在0.3以上，即可往下操作。注意樣品放置時(shí)間應(yīng)與空白對照溶液放置時(shí)間一致才有可比性。膽堿酯酶空白對照溶液3min的吸光度變化D A0值＜0.3 的原因：一是酶的活性不夠，二是溫度太低。
15.3 當(dāng)吸光度大到無法讀取時(shí)，說明測定液渾濁有干擾。
16 方法注釋
16.1 兩種方法的共同點(diǎn)：以上兩種方法的原理、緩沖（提取）溶液pH值、測定中的干擾物質(zhì)和排除方法基本相同。
16.2 速測卡法的檢出限：方法文本中的表1，是由衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所、廣東省食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所、北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所、香港政府化驗(yàn)所、廣東省農(nóng)藥檢定所、深圳市衛(wèi)生防疫站、華南農(nóng)大昆蟲毒理研究室七個(gè)單位，使用速測卡法，對我國常見使用的一些有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢出限的實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)表。從表1可以看出，在使用速測卡法檢出蔬菜樣品為農(nóng)藥陽性時(shí)，即可視為有機(jī)磷或氨基甲酸酯類的農(nóng)藥已超標(biāo)。在有條件的單位，可用氣相色譜儀或質(zhì)譜儀對陽性試樣進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來確定是哪種農(nóng)藥、確切含量。
16.3 酶抑制率法的選擇：在氣相色譜分析儀還未問世及分布較少時(shí)，對有機(jī)磷類農(nóng)藥的檢測即采取了酶抑制分光光度法，只是由于當(dāng)時(shí)酶的純度不夠高、靈敏度較低、酶試劑保存期短、及方法不能區(qū)分出具體的農(nóng)藥而被氣相色譜法所取代。而今用其作為快速分析則恰到好處。只是現(xiàn)在酶試劑的質(zhì)量還應(yīng)進(jìn)一步提高，有效保存期應(yīng)設(shè)法延長。由于這兩個(gè)現(xiàn)實(shí)情況，在實(shí)驗(yàn)前，必需測試酶的活性，達(dá)到要求后才能往下進(jìn)行。
16.4 速測卡法操作簡單、使用方便，常溫下試藥的有效期可達(dá)一年。酶抑制率光度法與速測卡法比較操作要煩瑣些，夏天時(shí)，試藥需要冷藏運(yùn)輸，但以數(shù)字形式讀取數(shù)據(jù)，較為直觀。中國糧油儀器網(wǎng) http://www.helpdeskservice.com.cn
