黃曲霉毒素檢測(cè)方法介紹
黃曲霉毒素（AFT）是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素是主要由黃曲霉 (aspergillus flavus) 寄生曲霉(a.parasiticus)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的機(jī)率最高。B1是最危險(xiǎn)的致癌物，經(jīng)常在玉米，花生，棉花種子，一些干果中常能檢測(cè)到。它們?cè)谧贤饩�照射下能產(chǎn)生熒光，根據(jù)熒光顏色不同，將其分為B族和G族兩大類及其衍生物。AFT目前已發(fā)現(xiàn)20余種。AFT主要污染糧油食品、動(dòng)植物食品等；如花生、玉米，大米、小麥、豆類、堅(jiān)果類、肉類、乳及乳制品、水產(chǎn)品等均有黃曲霉毒素污染。其中以花生和玉米污染最嚴(yán)重。家庭自制發(fā)酵食品也能檢出黃曲霉毒素，尤其是高溫高濕地區(qū)的糧油及制品種撿出率更高。
主要的幾種檢驗(yàn)檢疫方法:
1,薄層層析法
薄層層析(Thin-Layer Chromatography,TLC)是在黃曲霉毒素研究方面應(yīng)用最廣的分離技術(shù).自1990年,它被列為AOAC(Association of Official Agricultural Chemists)標(biāo)準(zhǔn)方法,該方法同時(shí)具有定性和定量分析黃曲霉毒素的功能.
2,液相色譜法
液相色譜(LiquidChromatography,LC)與薄層層析在許多方面具有相似性,二者互相補(bǔ)充.通常用TLC進(jìn)行前期的條件設(shè)定,選擇適宜的分離條件后,再用LC進(jìn)行黃曲霉毒素的定量測(cè)定.
3,免疫化學(xué)分析方法
利用具有高度專一性的單克隆抗體或多克隆抗體設(shè)計(jì)的黃曲霉毒素的免疫分析方法,也是最常用的黃曲霉毒素檢測(cè)方法.這類方法通常包括放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA),酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linked of Immunosorbent Assay,ELISA)和免疫層析法(Immunoaflinity Column Assay,ICA).它們均可以對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行定量測(cè)定.
(1) 免疫親和柱-熒光分光光度法和免疫親和術(shù)-HPLC法
免疫親和柱法和酶聯(lián)免疫吸附法雖然都可達(dá)到速簡(jiǎn)便效果,但酶聯(lián)免疫吸附法僅能檢測(cè)單一毒素(如黃曲霉毒素B1)含量,而且易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,難以控制.免疫親和柱法(包括熒光光度法和HPLC法)卻能達(dá)到既定量準(zhǔn)確又快速簡(jiǎn)便的要求.
免疫親和柱的使用可以避免傳統(tǒng)TLC和HPLC的缺點(diǎn),同時(shí)免疫親和柱與TLC和HPLC法結(jié)合可以大大提高工作效率,提高靈敏度和準(zhǔn)確度.
黃曲霉毒素免疫親和柱-熒光光度計(jì)法是以單克隆免疫親和柱為分離手段,用熒光計(jì),紫外燈作為檢測(cè)工具的快速分析方法.它克服了TLC和HPLC法在操作過(guò)程中使用劇毒的真菌毒素作為標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)物和在樣品預(yù)處理過(guò)程中使用多種有毒,異味的有機(jī)溶劑,毒害操作人員和污染環(huán)境的缺點(diǎn).同時(shí)黃曲霉毒素免疫親和柱-熒光光度計(jì)法分析速度快,一個(gè)樣品只需10-15min,比傳統(tǒng)方法快幾個(gè)小時(shí)甚至幾天時(shí)間;儀器設(shè)備輕便容易攜帶,自動(dòng)化程度高,操作簡(jiǎn)單,直接讀出測(cè)試結(jié)果,可以在小型實(shí)驗(yàn)或現(xiàn)場(chǎng)使用.可以進(jìn)行黃曲霉毒素總量 (B1B2G1G2)
的測(cè)定,檢測(cè)限可達(dá)到1ug/kg,達(dá)到黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)限量值以下測(cè)定范圍為1-300ug/kg.
黃曲霉毒素免疫親和柱-高效液相色譜法比傳統(tǒng)的HPLC法更加安全,可靠,靈敏度和準(zhǔn)確度高.它采用單克隆抗體免疫技術(shù),可以特效性地將黃曲霉毒素或其他真菌毒素分離出來(lái),分離效率和回收率高.
分析原理試樣中的黃曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取液經(jīng)過(guò)過(guò)濾,稀釋后,用免疫親和柱凈化,以甲醇將親和柱上的黃曲霉毒素淋洗下來(lái),在淋洗液中加入溴溶液衍生,以提高測(cè)定靈敏度,然后用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行定量.也可以將甲醇-黃曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中,對(duì)黃曲霉毒素B1,B2,G1,B2分別進(jìn)行定量分析.免疫親和柱是用大劑量的黃曲霉毒素單克隆抗體固化在水不溶性的載體上,然后裝柱而成.該方法的測(cè)定范圍0-300ug/kg.
(2) 酶聯(lián)免疫吸附法:
1996年,Nakane建立了辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體的測(cè)定技術(shù).由于該方法簡(jiǎn)便,敏感,特異,可作為多種抗原或抗體的測(cè)定,20世紀(jì)70年代后期,該方法引入真菌毒素的檢測(cè)中,下面介紹的是競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附間接法檢測(cè)黃曲霉毒素B1.
原理:將已知抗原吸附在固態(tài)載體表面,洗除末吸附抗原,加入一定量抗體與待測(cè)樣品(含有抗原)提取液的混合液,競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)后,在固相載體表面形成抗原抗體復(fù)合物.洗除多余抗體成分,然后加入酶標(biāo)記的抗球蛋白的第二抗體結(jié)合物,與吸附在固體表面的抗原抗體結(jié)合物相結(jié)合,再加入酶底物.在酶的催化作用下,底物發(fā)生降解反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì),通過(guò)酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)出酶底物的降解量,從而推知被測(cè)樣品中的抗原量.
(3) 微柱篩選法 可以用來(lái)半定量測(cè)定各種食品中黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2的總量.
原理:樣品提取液中的黃曲霉毒素被微柱管風(fēng)硅鎂型吸附層吸附后,在波長(zhǎng)365nm紫外光燈下顯示藍(lán)紫色熒光環(huán),其熒光強(qiáng)度與黃曲霉毒素在一定的光密度范圍內(nèi)成正比例關(guān)系.若硅鎂型吸附劑層未出現(xiàn)藍(lán)紫色熒光,則樣品為陰性(方法靈敏度為5-10ug/kg).由于在微柱上不能分離黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2,所以測(cè)得結(jié)果為總的黃曲霉毒素含量.
(4) 一步式黃曲霉毒素檢測(cè)金標(biāo)試紙法
一步式黃曲霉毒素檢測(cè)金標(biāo)試紙法是利用單克隆抗體而設(shè)計(jì)的固相免疫分析法.由此產(chǎn)生的一步式黃曲霉毒素快速檢測(cè)試紙可在5-10分鐘完成對(duì)樣品中黃曲霉毒素的定性測(cè)定.借助黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品,這種方法能估算黃曲霉毒素的含量,非常適用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試和進(jìn)行大量樣品的初選.
檢測(cè)方法分析
薄膜層析法和液相色譜法是目前國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)檢測(cè)機(jī)構(gòu)都在使用的方法,由于其檢測(cè)周期長(zhǎng),程序復(fù)雜,所需試劑繁多等缺點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)要求.隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,特別是免疫學(xué),生物化學(xué),分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,人們已創(chuàng)建了不少快速,簡(jiǎn)便,特異,敏感,低耗且適用的黃曲霉毒素檢測(cè)方法.而且以金標(biāo)試紙為代表的這些方法已經(jīng)被先進(jìn)國(guó)家所廣泛使用,引進(jìn)和消化這些先進(jìn)的方法是我們檢測(cè)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急.免疫親和柱法優(yōu)點(diǎn)很多,但由于檢測(cè)費(fèi)用過(guò)高,而無(wú)法普及.而一步式黃曲霉毒素檢測(cè)金標(biāo)試紙法似乎更適用于我國(guó),值得推廣.
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