果汁中嗜酸耐熱菌的檢測及控制
上個世紀(jì)九十年代后期，隨著我國果汁工業(yè)的發(fā)展，特別是濃縮果汁出口量的日益增長，國際市場對中國果汁的質(zhì)量要求愈加嚴(yán)格，不斷設(shè)置技術(shù)壁壘，果汁中嗜酸耐熱菌便是其中之一。最初，各果汁企業(yè)，研究檢測機(jī)構(gòu)對這類微生物污染都缺乏認(rèn)識，難以在生產(chǎn)環(huán)節(jié)上對其控制。隨后的幾年中，我們通過加強(qiáng)與外商、國外研究機(jī)構(gòu)的聯(lián)系溝通，接合果汁企業(yè)生產(chǎn)工藝，對果汁中這類微生物的來源及其對果汁質(zhì)量會產(chǎn)生怎樣的影響，如何檢測、控制這類微生物等問題進(jìn)行了深入地研究探索，協(xié)助眾多果汁企業(yè)改進(jìn)生產(chǎn)工藝條件，使其產(chǎn)品中嗜酸耐熱菌得到了很好的控制。目前，絕大多數(shù)濃縮果汁企業(yè)的產(chǎn)品已能滿足外商對此項(xiàng)指標(biāo)的要求，為了能使大家更好地認(rèn)識、解決果汁中嗜酸耐熱菌這一技術(shù)難題，我們認(rèn)為有必要對嗜酸耐熱菌的特征、檢測方法和工藝控制等方面的工作進(jìn)行總結(jié)，以便進(jìn)一步統(tǒng)一認(rèn)識，改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量。
一、嗜酸耐熱菌的種類和特征
濃縮果汁一般具有較低的pH值、水分活性低、糖度高等特點(diǎn)，在果汁加工、濃縮過程中還要經(jīng)過加熱處理，因此絕大多數(shù)的微生物都無法生存，只有很少的細(xì)菌、霉菌和酵母可以在濃縮果汁中存活。嗜酸耐熱菌就是這少數(shù)細(xì)菌中的一類。在pH值較低時，嗜酸耐熱菌可以形成具有耐熱性的芽胞，果汁生產(chǎn)中常用的巴氏殺菌難以將其殺滅。它的芽胞以休眠的形式存活：于濃縮果汁中，當(dāng)果汁復(fù)水后，適宜的條件會使芽胞萌發(fā)，生長，從而導(dǎo)致果汁產(chǎn)品香氣損失、口感變差、濁度升高、形成沉淀。值得注意的是，嗜酸耐熱菌存在并不一定使產(chǎn)品變質(zhì)，未變質(zhì)的果汁中也能檢測到該菌，變質(zhì)只在適當(dāng)條件下發(fā)生，一般會引起果汁香味損失及輕微渾濁。
1984年，有科研人員從巴氏殺菌后的腐敗蘋果汁中分離出一種嗜酸菌，該菌可以在26～55℃溫度范圍pH2.6～6.0的條件下生長，它的孢子具有極強(qiáng)的抗熱性，在較低的pH值時，工業(yè)巴氏殺菌后依然可以存活。1992年研究人員把這類嗜酸耐熱菌歸類于一個新的屬：genus.AlicydobacJllus。目前，該屬已知主要有三個種：Bacillusacidocaldarius，Bacillusacidoterrestris和Bacilluscycloheptanicus。
Alicyclobacillus屬的菌是嚴(yán)格的嗜酸菌，它們生長的pH范圍為2.0～6.0，生長溫度范圍為40～70℃，該屬菌需氧或兼性厭氧，當(dāng)環(huán)境和營養(yǎng)條件不利時可形成內(nèi)生孢子。
Alicyclobacillusacedocaldarius為需氧的革蘭氏陽性桿菌，可形成內(nèi)塵孢子，長2～3m，寬0.7～0.8rrm，形成5～6個細(xì)胞的短鏈。該種菌的孢子囊不膨脹，對熱的耐受能力較弱。該種菌的生長pH范圍為2.0～6.0，最適生長溫度為45～70℃，不需要生長因子。該種菌菌落扁平，邊緣不規(guī)則，不產(chǎn)生色素。該菌的主要來源為地?zé)岘h(huán)境。
Alicyclobacitlusacidoterrestfis為需氧的革蘭氏陽性桿菌，可形成內(nèi)塵孢子，長2.9～4.3pm，寬0.6～0.8rrm，內(nèi)生孢子為卵形。該種菌不需要生長因子，生長溫度范圍為35～55℃，最佳生長溫度為42～53℃，可生長的pH范圍為2.2～5.8，在5%氯化鈉條件下不能生長。該種菌苗落圓形，黃白色，不透明或半透明。
Alicyclobacilluscycloheptanicus為可形成內(nèi)生孢子的、需氧的革蘭氏陽性桿菌，細(xì)胞氏2.5～4.5um，寬0.35～0.55rrm，孢子呈卵形，孢子囊輕微膨脹。該菌菌落圓形，較小，黃白色，不透明，該種菌生長需要生長因子，其生長溫度范圍為40～53℃，最佳生長溫度為48℃左右，可生長的pH范圍為3.0～5.5，生長于含氨基酸和糖類的培養(yǎng)基中，
二、果汁中嗜酸耐熱菌的檢測
文獻(xiàn)中培養(yǎng)，鑒別嗜酸耐熱菌的培養(yǎng)基有很多種，目前各企業(yè)常用的有YSG培養(yǎng)墓，BSSA培養(yǎng)基、BAT培養(yǎng)基等。
BSSA培養(yǎng)基的主要成分為：
水合氯化鈣0.25g七水合硫酸鎂0.50g
硫酸胺0.20g磷酸二氫鉀3.0g
酵母提取物2.0g葡萄糖1.0g
可溶性淀粉2.0g微量擴(kuò)物質(zhì)元素適量
將各組分溶解于1000ml蒸餾水中，將培養(yǎng)基pH值調(diào)至3.7～4.0后，高壓滅菌。應(yīng)注意的是，因?yàn)樵谳^低的pH條件下，培養(yǎng)基中瓊脂的交聯(lián)度降低，難以形成固體培養(yǎng)基，所以要把瓊脂與其它培養(yǎng)基成分分開滅菌，使用前再混合。
由于常規(guī)果汁樣品中，嗜酸耐熱菌含量很少，因此多采用膜過濾法測定。取10克或10毫升果汁樣品加入到90毫升滅菌水中，混勻，在80℃水浴中保持10分鐘，以殺滅樣品中其它不耐熱菌，經(jīng)0.45m膜過濾后，將過濾膜置于BSSA固體培養(yǎng)基上，45～50℃培養(yǎng)4天。對過濾膜上生長的菌落計數(shù)，即為10克（或10毫升）樣品中嗜酸耐熱菌菌數(shù)。
對于不適合過濾的渾濁樣品，可使用BSSA液體培養(yǎng)基在50℃條件下增菌培養(yǎng)24小時，取1毫升增菌液于平皿中，加注BSSA固體培養(yǎng)基，于45～50℃培養(yǎng)4天，以判斷樣品是否為哨酸耐熱菌陽性。
在嗜酸耐熱菌中，Alicyclobacillusacidoterrestfis（AAT）為果汁主要有害菌，如何鑒別AAT是十分重要的，日前四處使用的AAT快速診斷法有RT-PCR法、過氧化物酶法等方法。其中過氧化物酶法已形成商業(yè)試劑盒。
過氧化物酶論斷的原理是：在培養(yǎng)基中添加vanillics酸，嗜酸耐熱菌可使vanillics酸產(chǎn)生大量的愈創(chuàng)木酚，在過氧化氫存在的酸性條件下，愈創(chuàng)木酚在過氧化物酶作用下可產(chǎn)生棕色化合物四聯(lián)愈創(chuàng)木酚。所以，可根據(jù)是否產(chǎn)生棕色合物來判斷是否AAT陽性。診斷視AAT含量不同，可在3～5小時內(nèi)完成。
三、嗜酸耐熱菌的來源及控制
嗜酸耐熱菌廣泛分布于世界各地，在多種酸性食品中都有存在。嗜酸耐熱菌的根本來源為土壤，其在土壤中含量可達(dá)100cfu/g以上。水果表面及果樹葉表面也存在有嗜酸耐熱菌，但研究表明，雨后采摘的水果表面嗜酸耐熱菌少于干燥季節(jié)采摘的水果，這可能是由于雨水沖刷，雨后水果表面灰塵少等原因造成的。
果汁加工廠中嗜酸耐熱菌的主要污染來自原料果本身，對水果充分沖洗是減少加工早期階段菌數(shù)的有力措施。果汁加工的最初環(huán)節(jié)中，嗜酸耐熱菌控制的關(guān)鍵在于沖洗水的質(zhì)量和有效沖洗，因此應(yīng)定期檢測沖洗水中嗜酸耐熱菌含量，確定洗果池中洗果水適宜的更換頻率，延長流水噴淋時間，以確保沖洗干凈。
果汁生產(chǎn)前期，加工溫度較低，嗜酸耐熱菌檢出量較少，生產(chǎn)后期，加工溫度升高，有利于嗜酸耐熱菌的生長。過濾前果汁中的嗜酸耐熱菌可以通過膜過濾去除。但有些企業(yè)往往在膜過濾后的產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)大量嗜酸耐熱菌，這多是由于生產(chǎn)線管路污染造成的，因此必須控制好清洗用水的質(zhì)量，加強(qiáng)加工生產(chǎn)線管路的清洗，采用適宜的清洗方法和清洗周期，以確保產(chǎn)品不發(fā)生嗜酸耐熱菌的再次污染。
對于濃縮果汁中嗜酸耐熱菌的控制亦可采用瞬時高溫滅菌，但應(yīng)注意控制好滅菌溫度和時間，不要影響產(chǎn)品的風(fēng)味。
目前，我國濃縮果汁產(chǎn)品的國家推薦性標(biāo)準(zhǔn)中尚未對嗜酸耐熱菌提出限量要求，有的企業(yè)為了應(yīng)對不同客戶的要求，要采用多種方法同時檢測嗜酸耐熱菌。我們希望能與各大果汁企業(yè)、檢測機(jī)構(gòu)聯(lián)合，制訂合理、實(shí)用的統(tǒng)一檢測、控制方法，為企業(yè)降低檢測成本，增強(qiáng)出口果汁產(chǎn)品的競爭力，也為國家加強(qiáng)進(jìn)口果汁產(chǎn)品管理提供依據(jù)。中國糧油儀器網(wǎng) http://www.helpdeskservice.com.cn
